细胞凋亡检测是生物医学研究中的一项关键技术，广泛应用于疾病机制探究和药物筛选等领域。本文将详细介绍如何使用EVO视讯的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会转移至膜外，暴露在细胞外环境中，并且细胞膜的通透性增加。此时，PS能够被特异性地结合于Annexin-V探针上。Annexin-V是一种钙（Ca²⁺）依赖性的磷脂结合蛋白，对PS具有极高的亲和力。此外，PI（碘化丙啶）是一种经济且稳定的核酸染料，通常无法透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以进入晚期凋亡和坏死细胞并使其细胞核染成红色。当Annexin-V与PI联合使用时，PI会被正常细胞及早期凋亡细胞排除，而晚期凋亡细胞和坏死细胞则显示双阳性染色。

实验材料准备

进行检测所需材料包括：

• EVO视讯的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
• 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
• 离心机
• PBS缓冲液
• 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

对于悬浮细胞：以1000g离心5分钟，去除上清。加入1mL预冷PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次以1000g离心5分钟并去除上清，保留细胞沉淀。

对于贴壁细胞：小心吸取细胞培养液并保存备用。用PBS洗涤后，加入适量不含EDTA的胰酶消化液以消化细胞，随后再加入之前收集的培养液，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液，再次以1000g离心5分钟并去除上清，重悬细胞沉淀。

2. 重悬细胞

加入195μL Binding Buffer轻轻重悬细胞至适宜的浓度。

3. 加入染料

① 向细胞中加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（磷脂酰丝氨酸外翻）。
② 接着加入10μL PI Stain，轻轻混匀，用于检测晚期凋亡细胞或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，以确保染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置合适的通道检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。
2. 设立三组对照以帮助校正背景信号并确定凋亡细胞的比例：未染色组（检测自然荧光）、PI单染组（确定PI阳性阈值）、AnnexinV-FITC单染组（确定AnnexinV阳性阈值）。

荧光显微镜检测

1. 离心后用少量Binding Buffer重悬细胞，并制成涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，AnnexinV-FITC通常发出绿色荧光，PI则为红色荧光。
3. 可通过拍照或计数进行凋亡细胞比例的定量分析。

注意事项

1. 整个操作过程中应尽量保持低温，以减少细胞代谢和染色过程中的自发荧光。
2. 避免长时间暴露于光线下，特别是FITC类染料，光照会引起荧光淬灭。
3. 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
4. 使用流式细胞仪时，请确保仪器已校准且通道设置正确。通过采用EVO视讯的先进技术，您将获得更高的实验准确性及可靠性。